ANALIZA EnFOCUS FSHD

ZASTĄP PRZESTARZAŁĄ HYBRYDYZACJĘ SOUTHERNA NOWYM BIONANO

Analiza Bionano EnFocus FSHD to usprawniona, niezawodna metoda cząsteczkowa, wykorzystywana do pomiaru ilości powtórzeń D4Z4. Metoda ta jest w 100% zgodna z Southern blot do pomiaru powtórzeń D4Z4 w liniach komórkowych pochodzących od osób z FSHD. Dodatkowo, metoda ta rozróżnia dopuszczalny haplotyp 4qA od niedopuszczalnego 4qB oraz rozpoznaje szereg D4Z4 obecnych na chr4 od częściowo homologicznego szeregu D4Z4 obecnego na chr10.

PRZYKŁADY

JAK DZIAŁA TECHNOLOGIA BIONANO

Przebieg pracy związany z obrazowaniem genomu Bionano rozpoczyna się izolowaniem DNA wielkości rzędu miliona par zasad. Pojedyncza reakcja enzymatyczna znakuje genom określonym motywem sekwencji występującym około 15 razy na 100kpz w genomie ludzkim. Długie wyznakowane cząsteczki DNA są linearyzowane w matrycach nanokanałowych na chipie Saphyr®  i obrazowane w niezwykle wydajny, zautomatyzowany sposób za pomocą urządzenia Saphyr® Genome Imaging Instrument. Korzystajac z dopasowań parami, cząsteczki są składane w lokalne mapy lub całe zespoły genomu de novo. Zmiany we wzorach lub odstępy między znacznikami są wykrywane automatycznie, w całym genomie w celu wywołania wszystkich wariantów strukturalnych

AUTOMATYCZNA DETEKCJA O PERFEKCYJNEJ ZGODNOŚCI

Dystrofia mięśniowo-łopatkowo-ramienna (FSHD) jest pospolitą dystrofią mięśniową o wyjątkowo skomplikowanym genotypie. Wykrywanie molekularne wymaga dopasowania odpowiedniego rozmiaru bardzo dużego powtórzenia w regionie subtelomerycznym chromosomu 4, poprawnego określenia czy allel jest patogenny oraz rozróżnienia powtórzenia na chromosomie 4 a niemal identycznym powtórzeniem na chromosomie 10, które nie jest związane z chorobą. Metody molekularne zawodzą, więc nieefektywny i niedokładny Southern Blot jest aktualnie wykorzystywany do molekularnej diagnozy tej choroby. Analiza Bionano EnFocus™ FSHD wykonuje całą detekcję automatycznie, a badania sprawdzające wykazują doskonałą zgodność ze złotym standardem.

Bionano posiada dwie chemiczne metody znakowania, jedną nasza najnowszą Direct Labeling i wcześniejsza oparta na endonukleazach nacinających.

Podstawowa chemiczna metoda Direct Label and Stain (DLS), rozpoznaje motyw 6-zasadowej sekwencji i przenosi do niej bezpośrednio znacznik fluorescencyjny w pojedynczym etapie enzymatycznym.

Poprzednia to etykietowanie oparte na nikazie, Nick-Label-Repair and Stain (NLRS). Nukleaza nacinająca tnie długie jednoniciowe cząsteczki DNA w określonym rozpoznanym miejscu, po czym następuje znakowanie fluorescsncyjne analogów nukleotydowych. Chemia NLRS wykorzystuje wiele enzymów dostępnych w handlu zapewniając większą elastyczność sekwencji docelowych. .

Learn more about DNA Bionano labeling kits.

LINEARYZACJA I ZNAKOWANIE

Wyznakowaną próbkę DNA pipetuje się na jedną z komór przepływowych Saphyr Chip™. Saphyr elektroforetycznie kontroluje ruch DNA w komorze przepływowej. Gradient micro- i nanostruktur delikatnie rozwija i prowadzi DNA do NanoChannels.

Nanokanały w Saphyr umożliwiają przejście tylko pojedynczej zlinearyzowanej cząsteczce DNA jednocześnie zapobiegając splątaniu się lub zwijaniu się cząsteczki z powrotem. Środowisko nanofluidyczne pozwala cząsteczkom na szybkie przemieszczanie się przez setki tysięcy równoległych kanałów  NanoChannels jednocześnie, umożliwiając wysokoprzepustowe przetwarzanie w celu budowania dokładnej mapy genomu Bionano.

Gdy DNA zostanie rozciągnięte wewnątrz nanokanałów, kamera Saphyr o wysokiej rozdzielczości rejestruje je. Długie cząsteczki wychodzące poza pole widzenia są spinane razem. Po zobrazowaniu, cząsteczki są przepłukiwane i proces jest powtarzany, umożliwiając obrazowanie cząsteczek DNA wielkości  ponad 25 Gbp na godzinę na komorę przepływową.

MONTAŻ GENOMOWYCH MAP DE NOVO

Nieobrobiony obraz oznakowanej długiej cząsteczki DNA zostaje przechwycony przez urządzenie Saphyr i przekształcone na cyfrowy obraz wzoru etykiety określonego motywu. Oprogramowanie do analizy danych Bionano Solve™ gromadzi dane de novo  w celu odtworzenia całej złożonej mapy genomowej.

Mapy genomu Bionano umożliwiają różne analizy wraz z tworzeniem rusztowań hybrydowych oraz wykrywaniem zmienności strukturalnych. Analizy Next-Generation Sequencing (NGS) często opierają się na dopasowaniu krótkich odczytów do odniesienia w celu wywnioskowania podstawowej struktury genomu. W tej strategii brakuje rozszyfrowania regionów, w których samo odniesienie jest nieprawidłowe lub znacząco różni się od interesującego nas genomu. Montaże Bionano nie są kierowane przez odniesienie, co pozwala na obiektywną rekonstrukcję struktury genomu.

Learn more about Bionano Data Solutions.

3 WAYS TO GET BIONANO DATA