NOWOTWORY

Próbki nowotworowe są  zbyt złożone do sekwencjonowania całego genomu o niskim pokryciu. Złożone rearanżacje, heterogeniczność guza oraz powtarzalne niesekwencjowalne regiony genomu stawiają dodatkowe wyzwania dla technologii krótkiego i długiego odczytu.

Urządzenie do obrazowania genomu Bionano Saphyr Genome Imaging Instrument znajduje zmiany strukturalne większe niż 500 par zasad, nieukierunkowane oraz obecne w całym genomie, z najwyższą czułością oraz najniższym odsetkiem fałszywie dodatnich zmian, we frakcji alleli poniżej 1%.

Przebieg pracy związany z obrazowaniem genomu Bionano rozpoczyna się izolowaniem DNA wielkości rzędu miliona par zasad. Pojedyncza reakcja enzymatyczna znakuje genom określonym motywem sekwencji występującym około 15 razy na 100kpz w genomie ludzkim. Długie wyznakowane cząsteczki DNA są linearyzowane w matrycach nanokanałowych na chipie Saphyr®  i obrazowane w niezwykle wydajny, zautomatyzowany sposób za pomocą urządzenia Saphyr® Genome Imaging Instrument. Korzystajac z dopasowań parami, cząsteczki są składane w lokalne mapy lub całe zespoły genomu de novo. Zmiany we wzorach lub odstępy między znacznikami są wykrywane automatycznie, w całym genomie w celu wywołania wszystkich wariantów strukturalnych. 

Mutacje inaktywujące gen BAP1  są cechą charakterystyczną czerniaka naczyniówki.  W modelu pochodzącym od pacjenta nie znaleziono mutacji ani zdarzenia epigenetycznego wyjaśniającego utratę ekspresji tego genu, ale Bionano zidentyfikował delecję 740 bp w promotorze BAP1. Ten wariant został pominięty w sekwencjonowaniu z powodu wysokiej zawartości GC w tym regionie.

Próbki z nowotworów często wykazują dużą liczbę zmian i ograniczeń strukturalnych spowodowanych przez krótki odczyt NGS, co jest szczególnie uciążliwe przy nadawaniu sensu skomplikowanym ciągom wydarzeń, takim jak w katastrofach chromosomalnych. W liniach komórkowych nowotworu piersi pochodzących od pacjentów, mapa konsensusowa wynikająca z połączenia dziesiątek cząsteczek obejmujących obszar, pozwoliło mapowaniu optycznemu na identyfikację następstw wynikających z translokacji, delecji oraz inwersji, omijanych przez sekwencjonowanie krótkiego oraz długiego odczytu.

Możliwość stratyfikacji próbek pacjentów opartej na profilu mutacyjnym wymaga zwykle obszernej obróbki bioinformatycznej po sekwencjonowaniu. W badaniach nad nowotworem wątrobowokomórkowym, nasz wbudowany pipeline automatycznie dostarcza wystarczające informacje do odróżnienia próbek posiadających lub nie sygnaturę stresu replikacji, wynikającą z insercji wirusa zapalenia wątroby typu B, 9 kbp od genu kodującego cyklinę E1. Wraz z rozwojem terapii innowacyjnych, takich jak inhibitory PARP, kluczowe znaczenie ma stratyfikacja pacjentów na podstawie uszkodzeń DNA..

W obszernych badaniach porównawczych pomiędzy mapowaniem optycznym a klasyczną cytogenetyką, Bionano zidentyfikował nowe, niewykryte fuzje, których nigdy wcześniej nie odnotowano.  W obu przedstawionych przypadkach jeden z dwóch partnerów fuzyjnych jest dobrze znany w leukemii, jednak pochodzi z innych genów. Zdarzenia te zostały pominięte przez klasyczną cytogenetykę z powodu niskich frakcji alleli oraz z powodu ukierunkowanego podejścia FISH, stosowanego w kontekście diagnostycznym.

Onkogeny są powszechnie amplifikowane na cząsteczkach pozachromosomalnego kolistego DNA  (ecDNA) w nowotworach, ale nasza wiedza na temat budowy ecDNA i jego wpływu na ekspresję genów jest ograniczona. Bionano wykorzystano do zbudowania szczegółowej mapy ecDNA w linii komórkowej gruczolaka jelita grubego, wykazując kolistą budowę, amplifikacje genów oraz breakpointy fuzyjne…