MONTAŻ GENOMU

Większość wyższych organizmów posiada powtarzalne genomy oraz wiele powtórzeń, które są niedostępne dla sekwencjonowania. Scaffolding długiego odczytu jest potrzebny do stworzenia ciągłych i dokładnych złożeń de novo. Kontigi sekwencyjne wraz z mapami Bionano pozwalają na prawidłowe złożenie ramion lub pełnych chromosomów. Bionano to jedyna technologia scaffolding’u, nie opierająca się na sekwencjonowaniu, która jest w stanie poprawiać kontigi chimeryczne oraz błędy scaffolding’u spowodowane przez Hi-C.  Wraz z całkowitą produkcją nawet 5 Tbp danych na próbkę, nawet największe genomy mogą zostać poddane pomyślnemu scaffolding’owi.

Przebieg pracy związany z obrazowaniem genomu Bionano rozpoczyna się izolowaniem DNA wielkości rzędu miliona par zasad. Pojedyncza reakcja enzymatyczna znakuje genom określonym motywem sekwencji występującym około 15 razy na 100kpz w genomie ludzkim. Długie wyznakowane cząsteczki DNA są linearyzowane w matrycach nanokanałowych na chipie Saphyr®  i obrazowane w niezwykle wydajny, zautomatyzowany sposób za pomocą urządzenia Saphyr® Genome Imaging Instrument. Korzystajac z dopasowań parami, cząsteczki są składane w lokalne mapy lub całe zespoły genomu de novo. Zmiany we wzorach lub odstępy między znacznikami są wykrywane automatycznie, w całym genomie w celu wywołania wszystkich wariantów strukturalnych

Optyczne mapy de novo firmy Bionano mogą zostać połączone ze składaniem sekwencji, aby uporządkować i ukierunkować fragmenty sekwencji, identyfikować i skorygować potencjalne złączenia chimeryczne w złożonej sekwencji oraz szacować wielkość przerwy między sąsiednimi kontigami. W tym celu oprogramowanie Bionano Solve™ importuje złożenia i identyfikuje oznaczone miejsca w danych sekwencjach, opierając się na znakowaniu konkretnych motywów sekwencji rozpoznawanych. Złożone sekwencje, odpowiadające danemu rusztowaniu hybrydowemu, są generowane oraz eksportowane do pliku FASTA lub AGP. Pipeline jest w pełni zintegrowany z Bionano Access™ który zapewnia dogodny interfejs do działania pipeline’u dla rusztowań hybrydowych oraz przeglądania otrzymanych wyników.

Narzędzia do scaffolding’u oparte na chromatografii oddziaływań hydrofobowych
(Hi-C) zyskały popularność dzięki ich możliwością do łączenia nawet najkrótszych sekwencyjnych kontigów w rusztowania o długości chromosomów. Jednakże, ta wysoce losowa metoda oparta na statystycznej interpretacji częstotliwości sieciowania (cross-links) chromatyny w jądrze, wykazuje dużą liczbę błędów w ukierunkowaniu i uporządkowaniu kontigów. Mapy Bionano mogą pomóc zidentyfikować i korygować te błędy.

Pipeline rusztowań hybrydowych Bionano wykrywa i rozwiązuje połączenia chimeryczne, które występują zazwyczaj, kiedy krótkie odczyty, cząsteczki lub insercje sparowanych końców nie są w stanie objąć całych długich powtórzeń DNA. Kiedy pipeline rusztowań hybrydowych wykryje sprzeczność, analizuje dane dotyczące pojedynczych cząsteczek zawartych w mapie Bionano i szacuje które złożenie zostało niepoprawnie utworzone. Jeżeli mapa Bionano wykazuje długie oparcie cząsteczkowe w miejscu sprzecznego rozwidlenia, kontig sekwencyjny zostaje automatycznie wycięty, usuwając domniemane łączenie chimeryczne (Ilustracja 3). Jeżeli nie posiada wystarczająco silnego oparcia cząsteczkowego mapa Bionano zostaje automatycznie wycięta. Wycięcia mogą by sprawdzane oraz ręcznie poprawione, po czym wszystkie kontigi oraz mapy ponownie zostaną poddane scaffolding’owi.