WYKRYWANIE ZMIENNOŚCI STRUKTURALNYCH
Technologia mapowania genomu Bionano bezpośrednio dotyczy cząsteczek o długości od 150 000 bp do megabase, w których identyfikuje duże zmiany strukturalne, zwykle nie wykrywane przez technologie sekwencjonowania krótkiego i długiego odczytu
IDENTYFIKACJA ZMIENNOŚCI SEKWENCYJNEJ
Identyfikacja zmienności sekwencji jest ważnym pierwszym krokiem określenia krytycznych czynników genetycznych fenotypu. Zmiany strukturalne (SV) wpływają na długie odcinki sekwencji a tym samym na wpływają na fenotyp.
Zachowanie ciągłości całego procesu mapowania genomu jest kluczowy dla wszelkich kompleksowych badań struktury i funkcji genomu, szczególnie w przypadku analizy zmienności strukturalnej w złożonych genomach. Mapowanie genomu Bionano zapewnia niespotykaną czułość w wykrywaniu dużych SV.1
- 99% czułość dla homozygotycznych insercji/delecji dłuższych niż 500 par zasad
- 95% czułość dla heterozygotycznych insercji/delecji dłuższych niż 500 par zasad
- 95% czułość dla zrównoważonych i niezrównoważonych translokacji dłuższych niż 50,000 par zasad
- 99% czułość na inwersje dłuższe niż 30 000 par zasad
- 97% czułość na duplikacje większe niż 30 000 par zasad
- 97% czułośc dla wariantów liczby kopii dłuższych niż 500 000 par zasad
W przypadku próbek mozaicyzmu i heterogenicznych próbek raka, Saphyr wykrywa wszystkie typy wariantów poniżej 1% wariantu frakcji alleli.
Aby zidentyfikować zmianę strukturalną, mapę genomu de novo można dopasować do genomu referencyjnego lub można dopasować dwie próbki bezpośrednio do siebie. Podczas dopasowywania mapy genomu do zestawu referencyjnego oprogramowanie Bionano identyfikuje lokalizację tej samej sekwencji rozpoznawczej, która jest używana do znakowanie cząsteczek DNA w genomie referencyjnym i dopasowuje odpowiednie wzorce znaczników w próbce i referencji. To dopasowanie zawiera wszystkie adnotacje odniesienia do genomu złożonego de novo .
Obserwując zmiany w odstępach między etykietami oraz porównując kolejność, pozycje i orientacje wzorów etykiet, automatyczne algorytmy zmian strukturalnych Bionano wykrywają wszystkie główne typy zmian strukturalnych.
Zmniejszenie odstępów między etykietami, z lub bez utratą etykiet, potwierdzają delecje. Odstępy między etykietami, które zwiększają się wraz z wykrytymi dodatkowymi etykietami lub bez, wskazują na insercje.
Przy użyciu podobnych metod można zidentyfikować rozszerzenie lub zmniejszenie macierzy tandemowych oraz segmentalne duplikacje. Gdy wzory etykiet są odwracane względem odniesienia, takie zjawisko nazywamy inwersją. Mapy genomu dopasowane do dwóch lub więcej różnych chromosomów lub lokalizacji genomu wskazują na translokacje.
BADANIA RODZINNE I KONTROLA PRZYPADKÓW
Bionano Variant Annotation Pipeline (VAP) usprawnia badania rodzinne i kontrolne. Używając VAP, możemy przeanalizować zmienności strukturalne z kilku próbek na raz, wykrywając zmiany strukturalne dziedziczne lub de novo. Pipeliny porównują zmiany strukturalne rodzica (-ów) z dzieckiem lub porównują wykryte zmiany strukturalne z guza z krwia tego samego pacjenta w celu wykrycia zmian somatycznych.
Korzystając z kontrolnej bazy danych typowych zmian strukturalnych, VAP filtruje tysiące zidentyfikowanych do setek rzadkich wariantów lub kilka wariantów de novo i genów na które wpływają. Wykrywanie zmian strukturalnych i VAP sa w pełni zintegrowane z Bionano Access™, który posiada wygodny interfejs do uruchamiania i przeglądania wyników analizy zmian strukturalnych.
ANALIZA ZMIAN STRUKTURALNYCH Z BIONANO
W przypadku Bionano obserwuje się zmiany strukturalne a nie wnioskuje, tak jak w przypadku NGS. Kiedy krótkie odczyty sekwencji NGS są dopasowywane do genomu odniesienia, algorytmy łączą fragmenty sekwencji próbując odbudować rzeczywistą strukturę genomu. W takim podejściu warianty strukturalne są wywnioskowane na podstawie fragmentarycznych danych z mieszanym sukcesem. Dzięki Bionano obrazuje się natywne cząsteczki DNA wielkości mega zasad, a większość dużych zmian strukturalnych lub ich punktów przerwania można zaobserwować bezpośrednio we wzorze znacznika na cząsteczkach.
Cząsteczka i wzorce mapy Bionano pokrywają się z chromosomem 5p odniesienia hg19, ale u tego osobnika sekwencja 90 kbp jest obecna w 4 tandemowych kopiach . Pojedyncze cząsteczki obejmują cały zakres 360 kbp tej tandemowej duplikacji.